以云南铁核桃为试材，微波采用微波辅助法进行色素提取试验，辅助采用单因素试验与正交实验对色素提取工艺进行优化，提取铁核桃果并对其稳定性及抗氧化活性进行研究，云南以期为云南铁核桃色素的皮色开发利用提供参考依据。结果表明：微波辅助提取云南铁核桃果皮色素最优工艺为微波功率480W，素及水浴浸提温度80℃、其理微波时间10s、化性料液比1∶70g·mL-1、质研乙醇浓度60%、微波水浴浸提时间60min。辅助云南铁核桃果皮色素热稳定性和光稳定性差，提取铁核桃果对pH较敏感，云南对常见食品添加剂较稳定，皮色对Ga2+、素及Na+、Mg2+、Sn2+稳定，对Fe3+、Cu2+不稳定；云南铁核桃果皮色素对ABTS+·、DPPH·、OH有较强的清除能力，而且随着浓度的增加而增大。
铁核桃(Juglanssigillata)属胡桃科山核桃属植物，别名山核桃。核桃具有适应性强、耐贫瘠、耐寒冷、扎根深、生长快、木材产量较高、果枝的坐果率较高等特点，是一种优质的农林经济作物，在云南各地区均有分布，资源丰富。据研究，铁核桃叶及花含有烷烃类、蒽醌类、多酚或醇类、黄酮类、多糖、强心苷、三萜类化合物及其挥发油、鞣质等化学成分，叶片提取物具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抑菌等作用。果实坚硬，可用于制作各种美观久耐的工艺品，有的还用作把玩核桃。果实具有厚厚的果皮，每逢核桃收获的季节，除少部分被用作燃料外，绝大部分被堆放在田间地头而腐烂，既浪费资源又会给环境带来负担。随着核桃产业的不断扩大，逐步引起研究者的重视，其中，对其化学成分及生物功能的研究报道相对较多，已从铁核桃外果皮中提取了60种多种化学成分，具有应用潜力的有效成分20多种，主要为生物碱类、醌类、黄酮类、酚类和酸类等生物活性的成分，有抗菌消炎、抗氧化、镇痛、抗肿瘤等作用。还有研究者把铁核桃外果皮用于制备吸附剂及生物炭，用来吸附环境中的污染物，表现出较好的吸附能力。此外，铁核桃外果皮富含天然色素，在食品及印染行业有较大应用潜能。
近年来，随着人们健康意识逐渐增强，对天然产品需求不断增大，从天然产物中提取色素，已经成为当今世界色素行业发展的新趋势[12]。罗金岳等研究发现，天然色素不仅安全性高，大多具有一定营养和保健功能，目前，有关核桃果皮的色素提取、成分分析、性质及应用研究不断增加，仲军梅对核桃青皮色素进行提取，结果表明色素提取液含有醌、鞣质、黄酮及其甙类成分以及K、Na、Mg等营养元素。具有耐光性好，耐还原能力比耐氧化能力强，对毛产品的皂洗、酸洗(pH5)、热水洗(65℃)、光照稳定性均较好等特点。凌庆枝等利用热水浸提法提取了安徽宁国山核桃的外果皮色素，并进了相关性质试验，研究表明安徽宁国山核桃的外果皮色素是一种混合物，呈酒红色，溶解性良好，对温度、食盐、乙醇、蔗糖等影响因子的稳定性较好，但对光的稳定性稍差。黄玥等利用超声辅助萃取的方法提取了核桃青果皮色素，发现该色素中主要含有单宁和黄酮，含量分别为28.07%和4.86%。惠晶等探究了水煮法提取核桃外果皮中的染料色素的最佳工艺，并确定青皮色素上染棉织物的最佳方法等。简未平等[18]将核桃青皮色素用于羊毛织物的染色试验，发现染色过程中起主要作用的影响因素是媒染剂Fe2+的用量，然后是染液用量、pH、温度，但有关云南铁核桃果皮色素的相关研究还较为少见。
因此，该研究以云南保山所产铁核桃果皮为试材，采用微波辅助法提取色素，考查了微波功率、微波时间、乙醇浓度、料液比、水浴浸提温度及水浴浸提时间对色素提取的影响，在单因素试验基础上采用正交实验优化提取工艺，并考查察了温度、pH、食品添加剂、金属离子对其稳定性的影响及测定了色素的抗氧化活性，以期为云南铁核桃果皮色素的开发与应用提供参考依据。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料：云南铁核桃果皮于2017年10月采自保山市隆阳区，洗净，鼓风干燥箱中55℃烘干，粉碎，得果皮样品粉，密封保存备用。
供试试剂：氢氧化钠、浓盐酸、蔗糖、柠檬酸、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、过硫酸钾、抗坏血酸均为分析纯，均购于阿拉丁试剂网。
供试仪器：722型分光光度计(上海第三分析仪器厂制造)、DFT-250C手提式万能高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司)、CP214电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)、800型离心沉淀器(上海手术器械厂)、SHZ-D(III)循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、G80F20CN2L-R8(R0)微波炉(广东格兰仕微波生活电器制造有限公司)、HH-4数显恒温水浴锅(常德国华电器有限公司)、N-1001旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司制造)、DHG-9030鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
1.2试验方法
1.2.1云南铁核桃果皮色素的提取
准确称取1g果皮样品粉放入具塞锥形瓶中，加入50%乙醇溶液30mL，混匀，置于家用微波炉中，在480W功率下间歇式加热浸提，每隔10s间歇1次，共加热20s后，放入70℃水浴锅中浸提60min，冷却，离心，收集上层清液至50mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容至刻度，在波长为510nm[19，20]处测定吸光度。
1.2.2单因素试验
固定料液比1∶30g·mL-1、乙醇浓度50%、微波加热时间20s、水浴浸提温度70℃、水浴浸提时间40min，选择微波功率分别为160、320、480、640、800W，研究微波功率对色素提取的影响。
固定料液比1∶30g·mL-1、乙醇浓度50%、微波功率480W、水浴浸提温度70℃、水浴浸提时间40min，选择微波时间分别为10、20、30、40、50s，研究微波时间对色素提取的影响。
固定料液比1∶30g·mL-1、微波功率480W、微波时间20s、水浴浸提温度70℃、水浴浸提时间40min，选择乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%，研究乙醇浓度对色素提取的影响。
固定乙醇浓度50%、微波功率480W、微波时间20s、水浴浸提温度70℃、水浴浸提时间40min，选择料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50g·mL-1，研究料液比对色素提取的影响。
固定料液比1∶30g·mL-1、乙醇浓度50%、微波功率480W、微波时间20s、水浴浸提温度70℃，选择水浴浸提时间分别为20、40、60、80、100min，研究水浴浸提时间对色素提取率的影响。
固定料液比1∶30g·mL-1、乙醇浓度50%、微波功率480W、微波时间20s、水浴浸提时间40min，改变水浴浸提温度分别为50、60、70、80、90℃，研究水浴浸提温度对色素提取率的影响。
选定上述条件按1.2.1方法进行色素提取。
1.2.3正交实验
在单因素试验的基础上，采用SPSS16.0软件进行显著性分析，结果表明，微波功率、微波时间、料液比、乙醇体积分数、浸提时间5个因素对铁核桃外果皮色素提取率均有显著影响。考虑试验成本，最终选取浸提时间(A)、料液比(B)、微波时间(C)、乙醇浓度(D)4个因素，采用L9(34)正交设计法优化提取工艺。因素与水平见表1。
1.2.4稳定性验证试验
各取等量的色素提取液10mL，分别置于50、60、70、80、90℃水浴中加热处理20min后，记录其颜色并测定吸光度，研究温度对云南铁核桃果皮色素提取液稳定性的影响。
各取等量的色素提取液40mL，分别置于暗室、室内、太阳光照环境下，每隔1h记录颜色及测定其吸光度，研究光照对云南铁核桃果皮色素提取液稳定性的影响。
各取等量的色素提取液10mL，使用一定浓度的盐酸、氢氧化钠溶液调节提取液的pH分别至1、3、5、7、9、11、13，摇匀静置5min后，分别测定其吸光度，研究pH对云南铁核桃果皮色素提取液稳定性的影响。
各取等量的色素提取液20mL，分别加入5mL一定浓度的蔗糖、食盐、柠檬酸、葡萄糖溶液，摇匀，静置10min后，分别测定其吸光度，研究食品添加剂对云南铁核桃果皮色素提取液稳定性的影响。
各取等量的色素提取液10mL，分别加入2mL不同浓度的含Ga2+、Na+、Mg2+、Sn2+、Fe3+、Cu2+离子溶液，摇匀，静置10min后，分别测其吸光度，研究金属离子对云南铁核桃果外皮色素提取液稳定性的影响。
1.3项目测定
1.3.1ABTS清除能力测定
ABTS清除能力参照范金波等方法进行测定。将10mL7.4mmol·L-1ABTS与10mL2.6mmol·L-1过硫酸钾混合均匀，室温避光放置12～16h，形成ABTS+储备液，然后用无水乙醇稀释，在波长为734nm处测定其吸光度，使吸光度值为0.702(无水乙醇调零)得工作液，密封保存备用。向5支10mL比色管中分别加入0.6mL不同浓度的色素提取液，再各加入7.4mLABTS+·工作液，振荡摇匀后置于30℃恒温水浴中反应6min，测定734nm波长下的吸光度Ax。同时以同体积的乙醇代替色素溶液为空白对照，测定吸光度A0，以同体积乙醇代替ABTS+·溶液作为样品对照，测定吸光度Ax0。以维生素C为对照。ABTS+·清除率(%)=A0-(Ax-Ax0)/A0×100。
1.3.2DPPH清除能力测定
DPPH·清除能力参照王之珺等方法进行测定。于5支10mL比色管中分别加入5.0mL不同浓度的色素样品液，再各加入5.0mL0.5mmol·L-1DPPH乙醇溶液，混合均匀后避光反应30min，在517nm处测定吸光Ax。以同体积的超纯水代替色素提取液为空白对照，测定吸光度A0，以同体积乙醇代替乙醇DPPH溶液为样品对照，测定吸光度Ax0。以维生素C为对照。DPPH·清除率(%)=A0-(Ax-Ax0)/A0×100。
1.3.3OH清除能力测定
OH清除能力参照郑宇翔等的方法进行测定。向5支10mL比色管中分别加入1mL不同浓度的色素提取液，再加入0.3mL9.0mmol·L-1FeSO4、最后加入0.25mL20mmol·L-1H2O2，震荡摇匀，静置10min后，各加入1mL9.0mmol·L-1水杨酸乙醇溶液摇匀，于37℃恒温水浴中反应30min，取出后冷却至室温。在510nm处测吸光度Ax。用等体积的超纯水代替样品液作空白对照并测定吸光度A0。以等体积超纯水代替水杨酸作为样品对照并测定吸光值Ax0。以维生素C为对照。·OH清除率(%)=A0-(Ax-Ax0)/A0×100。
1.4数据分析
采用SPSS16.0及Excel2010软件对数据进行分析，每组试验重复3次，取平均值。
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